探針法熒光定量PCR試劑盒制備工藝流程

　　探針法熒光定量PCR試劑盒制備工藝流程主要包括核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、探針設(shè)計(jì)合成、反應(yīng)體系配制以及熒光定量PCR檢測等步驟。具體流程如下：

　　1.核酸提取

　　樣本準(zhǔn)備：采集目標(biāo)樣本，如組織、血液或細(xì)胞。

　　RNA 提取：使用QIAGEN RNeasy Mini Kit或其他類似試劑盒，按照說明書進(jìn)行RNA提取，確保RNA的純度和完整性。

　　DNA 提取：若需從樣本中提取DNA，采用相應(yīng)的基因組DNA純化試劑盒進(jìn)行操作。

　　2.反轉(zhuǎn)錄

　　cDNA 合成：將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通常使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，此試劑盒包含去除基因組DNA的gDNA Eraser和反轉(zhuǎn)錄酶。

　　DNase I處理：在反轉(zhuǎn)錄前對Total RNA樣品進(jìn)行DNase I處理，以除去殘存的基因組DNA，避免對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成干擾。

　　3.探針設(shè)計(jì)合成

　　探針設(shè)計(jì)：根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性探針，一般選擇與目標(biāo)序列匹配的寡核苷酸探針，并在5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

　　探針合成：利用自動(dòng)化核酸合成儀器進(jìn)行探針的化學(xué)合成，并純化得到的探針以確保其質(zhì)量。

　　4.探針法熒光定量PCR試劑盒反應(yīng)體系配制

　　混合試劑：將PCR酶、dNTPs、緩沖液、Mg??、引物、探針和模板cDNA按比例混合，形成完整的PCR反應(yīng)體系。

　　分裝反應(yīng)液：將混合好的反應(yīng)液分裝到PCR管或多孔板中，每個(gè)反應(yīng)單元體積一致，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

　　5.熒光定量PCR檢測

　　PCR 擴(kuò)增：在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，通過設(shè)定特定的循環(huán)參數(shù)（變性、退火、延伸）來控制PCR過程。

　　熒光數(shù)據(jù)采集：儀器在每個(gè)循環(huán)后自動(dòng)采集熒光數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的變化，并根據(jù)Ct值計(jì)算初始模板量。

　　數(shù)據(jù)分析輸出：軟件自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，輸出檢測結(jié)果。