通用PCR試劑盒特點(diǎn)、常見的問題及出現(xiàn)這些問題的原因

　　通用PCR試劑盒適用于各種RNA制品的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及隨后的PCR擴(kuò)增。通用PCR試劑盒它采用M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，能夠獲得較長的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
 

　　因快速靈敏檢測通用具有重要意義，本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù)PCR原理開發(fā)的試劑盒。
 

　　通用PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：
 

　　1.即開即用，用戶只需要提供DNA模板。
 

　　2.引物經(jīng)過精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增通用，與其他植物沒有交叉反應(yīng)。
 

　　3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
 

　　4.PCRmix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。
 

　　5.本試劑盒足夠做40μL體系的PCR50次，但只能用于科研。
 

　　通用PCR試劑盒PCR常見的問題及原因：
 

　　一、產(chǎn)生彌散條帶：
 

　　1、在PCR反應(yīng)體系中一鏈產(chǎn)物的含量過高
 

　　2、減少引物的用量
 

　　3、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
 

　　4、在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會顯示為彌散背景。
 

　　3、由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
 

　　二、產(chǎn)生非特異性條帶：
 

　　1、用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNaseI重新處理樣品。
 

　　2、在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
 

　　三、產(chǎn)生大分子量的彌散條帶：
 

　　1、大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
 

　　2、對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)
 

　　四、在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果。